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pBM18A Toposmart Cloning Kit 克隆試劑盒
產品編號:JCL073-02
別名  
英文名  
pBM18A Toposmart Cloning Kit  克隆試劑盒
上海研謹生物專業銷售(pBM18A Toposmart Cloning Kit  克隆試劑盒)歡迎您咨詢訂購!
產品信息:
 
組分 JCL073-01 (20) JCL073-02 (20×3)
pBM18A Vector (20ng/ml ) 20ml 20ml×3
10×Toposmart 20ml 20ml×3
Control Insert LacZα 5ml 5ml
M13F(-47) Primer 0.1OD 0.1OD×3
M13R(-48) Primer 0.1OD 0.1OD×3
產品介紹:
pBM18ATopotsmart克隆試劑盒利用痘苗病毒的拓撲異構酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點將片段克隆到載體中,不僅適用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶擴增的平末端PCR產物,也可克隆由Taq、Tth和klenTaq等DNA聚合酶擴增的帶A尾的PCR產物。陽性克隆可用M13F(-47)和M13R(-48) 引物進行菌落PCR鑒定。SmaI和XhoI單酶切可將克隆片段酶切出來。載體的多克隆位點兩側具有SP6和T7 RNA聚合酶啟動子序列, 可用于體外RNA轉錄。載體不含LacZ基因,不能進行藍白斑篩選。

產品特點:

1. 使用各種DNA聚合酶擴增的PCR產物。
2. PCR 引物 5’端不能進行磷酸修飾,普通商業化引物即可。
3. 載體采用了新的制備工藝,無需藍白斑篩選。
4. 載體具有氨芐青霉素抗性。操作步驟

1. 連接反應

按下表,在一個 0.2ml PCR 管中依次加入
 
成分 體積
DNA 片段 0.5-8ml
pBM18A Vector 1ml
10×Toposmart 1ml
補水至總體積 10ml
 
加完試劑后,輕輕混勻低速離心,使溶液集中在管底。注意:此步驟不要在低溫條件下(冰水浴)上操作。

2. 反應溫度及片段要求

室溫下(20-30℃)放置 5-30 分鐘,然后將離心管放置在冰上。如當天不進行轉化實驗。請將連接產物置于-20℃保存。
注意:DNA 片段的用量見下表
 
片段大小(bp) 最佳用量(ng)
100-1000 20-50
1000-2000 50-100
2000-5000 100-200
室溫下(20-30℃)反應時間 5-30 分鐘,如果室溫較低,推薦使用 PCR 儀控溫。可以設置 25℃反應 5-30 分鐘。如果 PCR 產物電泳檢測僅有很銳利明亮的條帶, 無引物二聚體和非特異性條帶存在,可直接取 0.5-1ml 的 PCR 產物原液進行克隆。

3. 陽性對照反應

取 1ml 試劑盒提供的 1kb 長度的對照片段 LacZ 基因 α肽片段進行克隆,轉化具有α互補功能的大腸桿菌感受態細胞(如 DH5α,TOP10,Mach1T1 等)。菌液涂布在含有 IPTG 和 X-gal 的 LB 氨芐平板上,次日藍色菌落為陽性克隆,說明有片段插入,白色菌落為空載體。

4. 轉化

(1)取 5ml 連接產物到 50-100ml 剛剛融化的感受態細胞中,輕輕混勻,冰浴
20-30 分鐘。
(2)42℃水浴中熱擊 30 秒。
(3) 立刻置于冰水浴中 2 分鐘。
(4) 加入 300-500μl 無菌的不含抗生素的SOC 或 LB,37℃,200-250rpm 振蕩培養 60 分鐘。
注:小于 2kb 片段可以不復蘇,直接涂平板。
(5) 吸取 200ml 菌液涂布。為了得到更多的菌落,可以先 4000rpm 離心 1 分鐘,去掉部分上清,用移液器輕吹菌體,充分懸浮菌液,取全部菌液涂布,然后37℃培養過夜(12-16 小時)。
5. 陽性重組子的鑒定菌落 PCR
(1) 菌落PCR方法鑒定陽性克隆
 
① 用10ml吸頭挑選克隆至預先加有10ml無菌水或LB培養基的PCR管中, 吹打混合。
② 25ml PCR反應體系:取2ml細菌懸液為模板、加入5mM 濃度的M13F(-47)、
M13R(-48)各1ml進行PCR擴增。
③PCR擴增條件:95℃預變性5分鐘(裂解細胞,失活核酸酶),94℃變性10秒鐘,55℃退火10秒鐘,72℃延伸( 根據片段的大小決定延伸時間,通常每1min/1kb)X秒,30個循環,72℃后延伸5分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果,有強烈的明顯條帶的克隆為重組體,與插入片段大小相近【M13F(-47)、M13R(-48)引物在克隆位置的兩側,所以PCR 擴增出的DNA的長度比插入片段大229bp】可視為陽性克隆。菌落PCR 方法鑒定重組子時一定要設立一個不加菌液的陰性對照。
(2) 測序:用M13F(-47)、M13R(-48)通用引物對陽性質粒進行測序分析。

6. 

 
 
pBM18A載體圖譜7. 常見問題分析
(1) 重組子克隆菌少,或陽性率低:感受態效率低,使用轉化效率>5×107cfu/μg 的感受態細胞
(2) 連接反應在低溫下(如放碎冰上)操作,應該在室溫下操作。
(3) PCR 片段加入量太多或太少,按照推薦量加入。
(4) PCR 純度低,重新擴增或重新純化 PCR 產物。
(5) PCR 質量低,切膠時在紫外下照射時間長,需重新制備。
(6) PCR 擴增結束后,應該再延伸 5-10 分鐘,確保片段延伸完全。
(7) 轉化后沒有復蘇培養,可以加入SOC 或 LB,培養 60 分鐘。克隆基因可

能對宿主菌有毒性,比如某些編碼膜蛋白和DNA 結合蛋白的基因,某些啟動子和調節序列基因,或含有倒置或串聯重復序列的基因,選用室溫過夜培養平板,或換用低拷貝質粒載體。

載體序列:

>pBM18A 1952bp AAAGGCCCACCCGTGAAGGTGAGCCAGTGAGTTGATTGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA AAACGACGGCCAGCCAATTGAAGCTATTTAGGTGACACTATAGATATCGAGCTCGAGGATCCATGGTA
CCCGGGCGTGTCG CGACACGCCCGGGTCTAGACTGCAGCTCGAGGCATGCAAGCT
TTGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCCATCCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCGT CCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAAC TTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAA GGAAGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTC CTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTG GGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCC AATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGC AACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCAT CTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGC CAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATC ATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACC ACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTC CCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTC CGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCA CTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGA TGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATGAGGGCCCAAAT GTAATCACCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCC CCTGACGAGCATCACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATA CCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACC TGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCG GTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTT ATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTG GTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTAC GGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTCGGAAAAAGAGTT GGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGAT TACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAG
本產品僅供研究,不用于臨床診斷

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