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牛血管內(nèi)皮細(xì)胞分離液試劑盒
產(chǎn)品編號:VE2011B
別名 牛血管內(nèi)皮細(xì)胞分離液試劑盒 
英文名  
牛血管內(nèi)皮細(xì)胞分離液試劑盒
中文名稱:牛血管內(nèi)皮細(xì)胞分離液試劑盒
中文別名:牛血管內(nèi)皮細(xì)胞分離液試劑盒
產(chǎn)品類別:血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離
 
產(chǎn)品編號:VE2011B
 
產(chǎn)品名稱:牛血管內(nèi)皮細(xì)胞分離液試劑盒
 
產(chǎn)品規(guī)格:2X200ml/Kit
 
產(chǎn)品價格:¥1300.00元

本品用于分離牛血管內(nèi)皮細(xì)胞




“XXXX”動物血管內(nèi)皮細(xì)胞分離液實驗方法
 
技術(shù)文檔編號:TBD0043SOP
 
【產(chǎn)品規(guī)格】
 
2×200ml/Kit
 
【產(chǎn)品組成】
 
為方便廣大用戶使用,試劑內(nèi)容如下:
 
  名稱 產(chǎn)品編號 規(guī)格
       
A 分離液 1   200ml
       
B 分離液 2   200ml
       
C 試劑 F(贈品) F2013TBD 200ml
       
D 樣本稀釋液(贈品) 2010C1119 200ml
E 清洗液(贈品) 2010X1118 200ml
F 說明書   1 份
       
 
【實驗前準(zhǔn)備】
 
適用儀器:最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
 
【檢驗方法】
 
全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
 
  • 首先制備單細(xì)胞懸液,制備方法詳見“組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)(文檔編號:
 
TBD0004SOP)”。
 
  • 取一支離心管,依次小心加入分離液 1、分離液 2(體積比為 3:1,試劑總量與細(xì)胞懸液體積比為 2:1。如細(xì)胞懸液為 2ml,則先后加入分離液 1:3ml、分離液 2:1ml。試劑總量最少不低于 4ml。),制成梯度界面,各液面分層一定要清晰。
 
  • 用吸管小心吸取細(xì)胞懸液加于分離液液面上,500g,離心 25min(注:根據(jù)樣本量確定離心條件,血液樣本量越多,離心力越大,離心時間越長,具體離心條件需客戶自行摸索,以達(dá)到最佳分離效果)。
 
  • 離心后,此時離心管中由上至下分為六層。第一層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色內(nèi)皮細(xì)胞層(第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2)。第三層為環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層(下層50%分離液 2 及第二層白環(huán))。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì)胞層。第六層為紅細(xì)胞層。
 
  • 用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中,往所得離心管中加入 10ml 清洗液(產(chǎn)品編號:2010X1118),混勻細(xì)胞。
 
  • 250g,離心 10min。
 
  • 棄上清。
 
  • 用吸管以 5-10ml 清洗液(產(chǎn)品編號:2010X1118)重懸所得細(xì)胞。
 
  • 250g,離心 10min。
 
  • 重復(fù) 7、8、9,棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
 
分離圖例:
 
 
 
【差異貼壁法純化細(xì)胞】
 
(1)用內(nèi)皮細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號:TBD20180011)或內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基(產(chǎn)
 
品編號:TBD20180051)以 1.5-3×106 個/ml 的密度重懸細(xì)胞,將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞
 
板或細(xì)胞瓶中,放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
 
(2)2-4 小時內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體(俗稱為單核細(xì)胞)。
 
(3)10-24 小時內(nèi)貼壁的單個核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。
 
(4)不貼壁的為淋巴細(xì)胞。
 
注:
 
  • 無血清培養(yǎng)基中不含任何動物成分,為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8% 經(jīng)篩選的胎牛血清。
 
  • 完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清(血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定)。
 
  • 由于每種細(xì)胞的貼壁時間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡單的純化目的,此法成本相對較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰
性分選。
 
【注意事項】
 
  • 全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得最佳的實驗結(jié)果,最好在取樣 2h 內(nèi)進(jìn)行實驗,樣品存放時間越長,細(xì)胞分離效果越差。樣品放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
 
  • 本實驗最好不要使用高聚合材質(zhì)(如聚苯乙烯)的塑料制品,應(yīng)使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品,因為靜電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面,影響細(xì)胞分離效果。
 
  • 吸取過多的目的細(xì)胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。
 
  • 如所實驗后細(xì)胞得率或活性過低,請聯(lián)系技術(shù)支持以尋求幫助。
 
【儲存條件及有效期】
 
常溫保存,有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌,需無菌條件操作。無菌條件下操作,啟
 
封后置常溫保存。如 4℃保存,本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶,影響分離效果。
 
【參考值(參考范圍)】
 
本實驗內(nèi)皮細(xì)胞提取率大于 80%。
 
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例,用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。
 
  紅細(xì)胞   白細(xì)胞   血小板
           
    (4.0-10.0)×109  
含量(個/L) (4.0-5.5)×1012 中性粒細(xì)胞 淋巴細(xì)胞 單核細(xì)胞 (1.0-3.0)×1011
    50%-70% 20%-40% 3%-8%  
           
 
【可能存在的問題及解決方法】
 
  • 由于血液粘度或其他個體差異,可能會造成以下兩種情況:a:離心后細(xì)胞在上層的血漿層中或稀釋液層中,是由于轉(zhuǎn)速過小造成的,用戶可適當(dāng)增加轉(zhuǎn)速,每次增加以 50-100r/min 為基準(zhǔn),直至達(dá)到最佳分離效果。
b:離心后細(xì)胞在分離液中,是由于轉(zhuǎn)速過大造成的,用戶可適當(dāng)降低轉(zhuǎn)速,每次降低以 50-100r/min 為基準(zhǔn),直至達(dá)到最佳分離效果。
 
本分離液的密度與氣壓、溫度,以及樣本差異,客戶需要對離心條件進(jìn)行調(diào)整,建議調(diào)整時,恒定離心時間,調(diào)整轉(zhuǎn)速來達(dá)到最佳分離效果。
 
  • 需要分離的樣本差異,可能對離心效果有影響:a:需要分離的樣本量過大或細(xì)胞密度過高,可能造成離心效果不佳。b:需要分離的樣本中細(xì)胞密度過低,離心后可能造成環(huán)狀乳白色細(xì)胞層模糊不清。客戶可適當(dāng)調(diào)整細(xì)胞密度,直至達(dá)到最佳分離效果。
 
  • 本公司分離液符合國家各項標(biāo)準(zhǔn),如有紅細(xì)胞沉降不完全的情況,有可能是樣本量過大,離心管中樣本的高度過高,在離心過程中樣本通過分離液的時間不同造成的。用戶可通過適當(dāng)提高轉(zhuǎn)速,直至達(dá)到最佳分離效果。
 
  • 在對轉(zhuǎn)速進(jìn)行加減的嘗試中,離心力最小不得小于 450g,最大不得大于 1200g,離心時間以 20-30min 為準(zhǔn)。
【相關(guān)實驗技術(shù)方案】
 
  • 所獲得內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
 
  • 所獲得內(nèi)皮細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
 
  • 所獲得內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定方法
 
A.流式細(xì)胞技術(shù) B.免疫組化技術(shù) C.原位雜交技術(shù) D.PCR 技術(shù)
 
 
【可能存在的問題及解決方法】
 
1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示:
 
出現(xiàn)情況 出現(xiàn)原因 建議解決方案
     
離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速
   
離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長
 
     
離心后白環(huán)層彌散 細(xì)胞密度過大 調(diào)整細(xì)胞密度
   
離心后白環(huán)層太淺或看不見 細(xì)胞密度過小
 
     
 
  • 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心,其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對離心條件進(jìn)行調(diào)整時,恒定離心時間,對離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
 
  • 本分離液依照國際標(biāo)準(zhǔn),全部使用藥用級原料,性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同,可
 
能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況,可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
 
注:在對離心條件進(jìn)行調(diào)整時,離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù),直至達(dá)到最佳分離效果,離心力最小不得小于 400g,最大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準(zhǔn)。
 
 
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