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可能影響酶免疫測定ELISA結(jié)果的標(biāo)本內(nèi)源性干擾因素

可能影響酶免疫測定ELISA結(jié)果的標(biāo)本內(nèi)源性干擾因素
 
內(nèi)源性干擾因素一般包括類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、高濃度的非特異免疫球蛋白、異嗜性抗體、某些自身抗體、因使用鼠抗體治療或診斷誘導(dǎo)的抗鼠Ig抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)等。在日常的臨床血清(漿)標(biāo)本中,有相當(dāng)比例不同程度的含有上述各種干擾物質(zhì),從而導(dǎo)致測定結(jié)果的假陽性。
1.類風(fēng)濕因子(rheumatoid factors,RF)在類風(fēng)濕患者、其他疾病以及正常人血清中,常含有較高或不同濃度的RF,RF一般為TgM型,亦有IgG和IgA型,RF具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點(diǎn),因?yàn)樵贓LISA測定中,其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標(biāo)的特異抗體IgG結(jié)合,從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。尤其是在捕獲法IgM型特異抗體的測定中表現(xiàn)最為明顯,因?yàn)榇藭r(shí)固相包被的抗體為抗人弘鏈抗體,IgM型RF的存在可使其大量結(jié)合于固相。為避免RF對ELISA測定的干擾,通??梢圆扇∠率龃胧?br> (1)稀釋標(biāo)本:這在判斷急性病原體感染的特異IgM抗體如抗HAVIgM,抗HBclgM, TORCH的IgM抗體檢驗(yàn)等尤為有用。因?yàn)榧毙愿腥緯r(shí),血循環(huán)中特異的IgM抗體滴度通常很高,而RF滴度通常相對要低得多。因此,在測定前對標(biāo)本進(jìn)行稀釋,特異的IgM因高滴度存在仍可檢出,而非特異的RF則會因?yàn)橄♂屪兂煞浅5偷牡味?,從而對測定幾乎不產(chǎn)生干擾?,F(xiàn)在,有些特異IgM檢測ELISA試劑盒不要求稀釋標(biāo)本,直接檢測,這樣雖然方便了實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的操作,但容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果,并且由于某些慢性感染,如HBV的感染,血循環(huán)中抗HBelgM可持續(xù)以一定的滴度存在,標(biāo)本不做稀釋即進(jìn)行檢測,即可出現(xiàn)陽性結(jié)果,從而失去抗HBclgM用于HBV急性感染的診斷價(jià)值。因此,在臨床實(shí)驗(yàn)室,一定要使用要求對標(biāo)本做1:1000稀釋的試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn),從而保證相應(yīng)檢測項(xiàng)目結(jié)果的可靠性及臨床應(yīng)用價(jià)值。
(2)改變酶標(biāo)抗體:由于RF結(jié)合的是IgG的Fc片段,如果將待酶標(biāo)的抗體的F,片段酶切夫除,僅留下具有特異結(jié)合功能的F(ab’)2部分標(biāo)記酶,則在測定中即可避免RF的干擾。
(3)標(biāo)本中RF用變性IgG預(yù)先封閉:將經(jīng)熱變性(63℃,10min)的動物如兔、羊等的IgG加入到標(biāo)本稀釋液中,或是將該變性IgG連接至一顆粒固相如聚苯乙烯微球或微孔,然后加入臨床血清標(biāo)本,反應(yīng)后,再吸出標(biāo)本進(jìn)行檢測。此外,在測定特異IgM時(shí),也可使用抗人IgG去除臨床標(biāo)本中RF和IgG。
(4)測定抗原時(shí),可在標(biāo)本中加入可使RF降解的還原劑:如2—巰基乙醇。2—巰基乙醇等還原劑可使抗體內(nèi)的巰基裂解,因而可以去除RF的干擾,但只適用于抗原測定。
(5)包被或酶標(biāo)二抗使用特異的雞抗體IgY:RF不與雞IgY反應(yīng),如果包被和酶標(biāo)二抗均為雞IgY抗體,則不受標(biāo)本中RF的干擾。
2.補(bǔ)體在固相酶免疫測定中,來自哺乳動物的固相特異抗體和酶標(biāo)二抗均有激活人補(bǔ)體系統(tǒng)的功能。一方面,固相抗體和酶標(biāo)二抗可因?yàn)槠湓诠滔辔郊敖Y(jié)合過程中,抗體分子發(fā)生變構(gòu),從而其F, 段的補(bǔ)體C1,結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來,這樣C1,就成為一個(gè)中介物將二者交聯(lián)起來,從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另一方面,固相抗體也會因?yàn)榛罨a(bǔ)體的結(jié)合,封閉抗體的抗原表位結(jié)合能力,而引起假陽性結(jié)果或使定量測定結(jié)果偏低。由補(bǔ)體引起的干擾可通過下述方法避免:
(1)對臨床血清標(biāo)本加熱滅活補(bǔ)體:采用56~C30min加熱可使標(biāo)本中的補(bǔ)體C1。滅活。
(2)包被或酶標(biāo)二抗使用特異的雞抗體:雞抗體不激活人的補(bǔ)體系統(tǒng),因此,使用特異的雞抗體,不會出現(xiàn)因補(bǔ)體激活而存在的假陽性和假陰性干擾。
3.異嗜性抗體(heterophilieantibodies)人類血清中含有抗嚙齒類動物(如鼠、馬、羊等)的免疫球蛋白(lg)的抗體,即天然的異嗜性抗體。有研究表明,天然的異嗜性抗體(lgG)可分為兩類,一類(85%的假陽性由其引起)可結(jié)合于山羊、小鼠、大鼠、馬和牛IgG的Fab區(qū)域,但不與兔IgG的Fab區(qū)結(jié)合。另一類(15%的假陽性由其引起)可結(jié)合于小鼠、馬、牛和兔IgG的Fc區(qū)表位,但不與山羊和大鼠IgG的Pc區(qū)表位結(jié)合。異嗜性抗體可通過交聯(lián)固相和酶標(biāo)的單抗或多抗而出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。由異嗜性抗體引起的干擾可通過下述方法避免:
(1)使用特異的兔F(ab’)2。片段作為固相或測定酶標(biāo)抗體。
(2)在標(biāo)本或標(biāo)本稀釋液中加入過量的動物Ig,封閉可能存在的異嗜性抗體。但加入量不足或亞類不同時(shí)無效。
(3)使用靶特異的非Ig親和蛋白(affibody)替代固相或酶標(biāo)抗體之一。采用噬菌展示來自單個(gè)金黃色葡萄球A蛋白(SPA)聯(lián)合文庫的人IgA結(jié)合親和蛋白,用于IgA的測定,不受異嗜性抗體的影響。
4.因使用鼠抗體治療或診斷誘導(dǎo)的抗鼠Ig抗體在臨床上,有嘗試使用鼠源性單克隆抗體進(jìn)行靶向治療,及使用放射性核索標(biāo)記鼠源性單克隆抗體進(jìn)行影像診斷等,均有可能使相應(yīng)患者體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體。這種抗鼠抗體對使用鼠源性單克隆抗體的酶免疫測定,可產(chǎn)生假陽性結(jié)果。由抗鼠抗體引起的干擾可通過下述方法避免:
(1)使用的特異的抗體(F,。bf):片段作為固相或測定酶標(biāo)抗體。
(2)在標(biāo)本或標(biāo)本稀釋液中加入過量的鼠Ig,封閉可能存在的抗鼠抗體。
(3)使用特異的雞抗體IgG作為固相和測定抗體。雞IgG不與人抗鼠抗體反應(yīng)。因而,用其作為固相或酶標(biāo)抗體不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
5.自身抗體   自身抗體如抗甲狀腺球蛋白、抗胰島索等,能與其相應(yīng)靶抗原結(jié)果形成復(fù)合物,在ELISA方法中可干擾相應(yīng)原抗體的測定。為避免以上情況出現(xiàn),可在測定前用理化方法將其解離。
6. 溶菌酶溶菌酶可與等電點(diǎn)較低的蛋白有強(qiáng)的結(jié)合能力。免疫球蛋白等電點(diǎn)約為5,因此,在雙抗體夾心法ELISA測定中,溶菌酶可在包被的IgG和酶標(biāo)的IgG間形成橋接,從而導(dǎo)致假陽性。因此,為保證ELISA測定的可靠性,有必要從標(biāo)本中去除溶菌酶或?qū)⑵浞忾],Cu2+離子和卵白蛋白可有效地封閉溶菌酶,防止其連接IgG。
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