多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)試劑盒說明書
微量法
正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
PPO(EC1.10.3.1)主要存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是一種含銅的氧化酶, 能使一元酚和二元酚氧化產(chǎn)生醌,從而引起褐化,與果蔬加工、茶葉品質(zhì)和組培等密切相關(guān)。
測定原理:
PPO 能夠催化鄰苯二酚產(chǎn)生醌,后者在 525nm有特征光吸收。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存; 試劑一:20mL×1 瓶,4℃保存; 試劑二:5mL×1 瓶,4℃保存; 試劑三:10mL×1 瓶,4℃保存;
粗酶液提取:
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃ 離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)或果汁樣本的處理:
按照血清(漿)或果汁體積(mL):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議取0.1mL血清
(漿)或果汁加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
測定步驟:
1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至525nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定(在 EP 管中依次加入下列試劑)
試劑名稱(μL) |
測定管 |
對照管 |
試劑一 |
200 |
200 |
試劑二 |
50 |
50 |
樣本 |
50 |
|
煮沸的樣本 |
|
50 |
37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)中準(zhǔn)確水浴10min 后迅速放入冰浴中冷卻
充分混勻,10000g,常溫離心10min,收集上清,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,525nm 處檢測測定管和對照管吸光度,計算 ΔA=A測定-A對照。
注意:每個測定管需要設(shè)一個對照管。可以在不同對照管中加入不同樣品的粗酶液,然后集中進行 1min 沸水浴處理。
PPO 活性計算:
a.
用微量石英比色皿測定的計算公式如下1、血清(漿)或果汁PPO活性
單位的定義:每分鐘每mL血清(漿)或果汁在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01 為一個酶活力單位。
PPO(U/mL)=ΔA×V 反總÷(V 液× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =80×ΔA÷V 液
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 PPO 活性
(1) 按樣本蛋白濃度計算:
單位定義:每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個酶活力單位。
PPO(U/mg prot)=ΔA×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷0.01÷T =80×ΔA÷Cpr 此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2) 按樣本鮮重計算:
單位定義:每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個酶活力單位。PPO(U/g 鮮重)=ΔA×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =80×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:
單位定義:每分鐘每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個酶活力單位。
PPO(U/104cell)=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =0.16×ΔA
V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.4mL;V 液:加入血清(漿)或果汁體積,0.1mL;V 樣:加入樣本體積,0.05mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,10 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。
b.
用96孔板測定的計算公式如下1、血清(漿)或果汁PPO活性
單位的定義:每分鐘每mL血清(漿)或果汁在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005 為一個酶活力單位。
PPO(U/mL)=ΔA×V 反總÷(V 液× V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =160×ΔA÷V 液
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 PPO 活性
(1) 按樣本蛋白濃度計算:
單位定義:每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個酶活力單位。
PPO(U/mg prot)=ΔA×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷0.005÷T =160×ΔA÷Cpr 此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2) 按樣本鮮重計算:
單位定義:每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個酶活力單位。
PPO(U/g 鮮重)=ΔA×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =160×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:
單位定義:每分鐘每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個
酶活力單位。
PPO(U/104cell)=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =0.32×ΔA
V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.4mL;V 液:加入血清(漿)或果汁體積,0.1mL; V 樣:加入樣本體積,0.05mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,10 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。