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線粒體復合體Ⅳ試劑盒說明書

線粒體復合體Ⅳ試劑盒說明書
微量法
正式測定前務必取 2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
線粒體復合體Ⅳ又稱細胞色素C氧化酶,也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分,負責催化還原型細胞色素C的氧化,并最終把電子傳遞給氧,生成水。
測定原理:
還原型細胞色素C在550nm有特征光吸收,線粒體復合體Ⅳ催化還原型細胞色素C生成氧化型細胞色素C,因此550nm光吸收下降速率能夠反映線粒體復合體Ⅳ酶活性。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:液體 100mL×1 瓶,-20℃保存;
試劑二:液體 20mL×1 瓶,-20℃保存;
試劑三:液體 1.5mL×1 瓶,-20℃保存;
試劑四:液體 20mL×1 瓶,4℃保存;
試劑五:粉劑×1 支,-20℃保存;
試劑六:粉劑×1 支,-20℃保存;
樣本的前處理:
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
1、準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、將勻漿 600g,4℃離心 5min。
3、棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11100g,4℃離心 10min。
4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅳ(此步可選做)。
5、步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復30次),用于復合體Ⅳ酶活性測定。
測定步驟:
1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至550nm,蒸餾水調零。
2、樣本測定
(1)工作液的配制:臨用前將試劑五和試劑六依次轉移到試劑四中混合溶解,置于37℃(哺
乳動物)或 25℃(其它物種)孵育5min;用不完的試劑 4℃可保存一周;
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和200μL工作液,混勻,立即記錄550nm
處初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2,計算 ΔA=A1-A2。
注意點: 若 ΔA 大于0.2,需將樣本用試劑二稀釋適當倍數(計算公式中乘以相應稀釋倍數),
使 A1-A2 小于 0.2,可提高檢測靈敏度。
復合體Ⅳ活力單位的計算:
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化降解1nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅳ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T
=1099×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
(2) 按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘催化降解1nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅳ活力 (nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d )×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=222×ΔA÷W
(3) 按細菌或細胞密度計算
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化降解1nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅳ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.444×ΔA
V 反總:反應體系總體積,2.1×10 -4 L;ε:細胞色素 C 摩爾消光系數,1.91×104 L/ mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數,500 萬。
b.使用 96 孔板測定的計算公式如下:
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化降解1nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅳ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T
=2198×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
(2) 按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘催化降解1nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅳ活力 (nmol/min/g 鮮重 )=[ΔA×V反總÷(ε×d )×109]÷(W×V樣 ÷V樣總)÷T=444×ΔA÷W
(3) 按細菌或細胞密度計算
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化降解1nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅳ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.888×ΔA
V 反總:反應體系總體積,2.1×10 -4 L;ε:細胞色素 C 摩爾消光系數,1.91×104 L/mol/cm;d:96 孔板光徑,0.5cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202mL;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數,500 萬。
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