天天操天天干天天做-天天操天天搞-天天操天天看-天天操天天噜-天堂电影免费在线资源-天堂电影在线

您好,上海研謹(jǐn)生物科技有限公司!
服務(wù)熱線:400-665-0203
研謹(jǐn)手機版

線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說明書

線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說明書
微量法
正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
線粒體復(fù)合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶,廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,由F1和F0兩個亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成,也可逆過程水解ATP。此外,復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細(xì)菌中。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。
測定原理:
復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi,通過測定Pi增加速率來測定復(fù)合體Ⅴ活性。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:100mL×1 瓶,-20℃保存;
試劑二:80mL×1 瓶,-20℃保存;
試劑三:2mL×1 瓶,-20℃保存;
試劑四:粉劑×1 支,-20℃保存;臨用前加入2mL蒸餾水,充分溶解備用,用不完的試劑仍-20℃保存;
試劑五:8mL×1 瓶,4℃保存;
試劑六:粉劑×1 瓶,4℃保存;臨用前加入4mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;
試劑七:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;
試劑八:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;
試劑九:液體 10mL×1 瓶,室溫保存。
定磷試劑的配制:按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染(請根據(jù)需要,用多少配多少)。
注意:配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。
樣本的前處理:
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
① 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿 600g,4℃離心 5min。
③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心 10min。
④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅴ(此步可選
做)。
⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入800uL試劑二和8uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于復(fù)合體Ⅴ酶活性測定。
測定步驟:
1、 酶促反應(yīng)(在EP管中加入下列試劑)
試劑名稱(μL) 對照管 測定管
試劑四 20 20
試劑五 80 80
樣本   100
混勻, 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)準(zhǔn)確水浴 30min
試劑六 40 40
樣本 100  
混勻,4000g,25℃離心 10min,取上清液
2、 定磷(在EP管或96孔板中加入下列試劑)
上清液 30 30
定磷試劑 170 170
混勻,室溫靜置10min后,在660nm處讀取A測定管和A對照管,計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管設(shè)一個對照管。
復(fù)合體Ⅴ活性計算:
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:
標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y= 1.2487x + 0.0361;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mmol/L),y為A 值。
1、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(V樣×Cpr) ÷T=64× (ΔA-0.0361) ÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2)按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min /g 鮮重)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T =51.7× (ΔA-0.0361) ÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/104cell)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.103× (ΔA-0.0361)
V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.4×10-4 L; V 樣:加入樣本體積,0.1 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.808 mL;T:反應(yīng)時間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。
b.使用96孔板測定的計算公式如下:
標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y=0.624x + 0.0361;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mmol/L),y 為A 值。
1、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(V 樣×Cpr) ÷T=128× (ΔA-0.0361) ÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2)按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T=103.4× (ΔA-0.0361) ÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol無機磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min /104cell)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.206× (ΔA-0.0361)
V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.4×10-4 L;V 樣:加入樣本體積,0.1 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.808 mL;T:反應(yīng)時間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。
研謹(jǐn)手機版
在線客服

微信賬號
主站蜘蛛池模板: 日韩成人在线观看| 欧美性xxx| 1024手机在线播放| 一区二区三区国产| 中文字幕在线精品视频入口一区 | 国产高清在线不卡| 亚洲欧洲视频在线观看| 一个人看的免费视频www| 2019亚洲日韩新视频| 国产亚洲午夜精品a一区二区| freexxxx性大陆另类| 亚洲日本韩国欧美| 日韩在线视频中文字幕| 亚洲成人网页| 999久久免费高清热精品| 波多野结衣在线中文字幕| 成人在线观看不卡| www.色综合| 日韩成a人片在线观看日本| 国产精品麻豆综合在线| 日韩伦理片在线观看光棍影院| 狠狠色狠狠色综合日日92| 一区在线免费观看| 亚洲欧美日韩综合网导航| 欧美va天堂| 1024国产精品视频观看| 成人免费午夜视频| 一品毛片| 一个人看的www在线视频播放| 一区二区不卡| 福利片 在线| 日韩av线观看| 欧美色图亚洲图片| 亚洲夜夜骑| 国产欧美日韩在线观看精品 | 在线观看成人小视频| 欧美高清 hd video| 樱花aⅴ一区二区三区四区| 久久com| 欧美日韩加勒比一区二区三区| 亚洲天堂ww|