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線粒體復(fù)合體Ⅲ試劑盒說(shuō)明書

線粒體復(fù)合體Ⅲ試劑盒說(shuō)明書
微量法
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
線粒體復(fù)合體Ⅲ(EC  1.10.2.2) 又稱 CoQ-細(xì)胞色素C還原酶,廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分,負(fù)責(zé)把還原型CoQ的氫傳遞給細(xì)胞色素C,生成還原型細(xì)胞色素C。
測(cè)定原理:
與氧化型細(xì)胞色素C不同,還原型細(xì)胞色素C在550nm有特征光吸收,因此550nm光吸收增加速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅲ酶活性。
需自備的儀器和用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:液體 100mL×1 瓶,-20℃保存;
試劑二:液體 20mL×1 瓶,-20℃保存;
試劑三:液體 1.5mL×1 支,-20℃保存;
試劑四:液體 20mL×1 瓶,4℃保存;
試劑五:粉劑×1 支,-20℃保存;
試劑六:液體 2.5mL×1 瓶,-20℃保存;
樣本的前處理:
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
1、準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、將勻漿600g,4℃離心5min。
3、棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11100g,4℃離心10min。
4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅲ(此步可選做)。
5、步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于復(fù)合體Ⅲ酶活性測(cè)定。
測(cè)定步驟:
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
(1)工作液的配制:將試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解,置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其
它物種)孵育5min;用不完的試劑4℃可保存一周;
(2)在微量石英比色皿或96孔板中依次加入10μL樣本、200μL工作液和25μL試劑六,立即混勻,記錄550nm處初始吸光值A(chǔ)1和2min后的吸光值A(chǔ)2,計(jì)算ΔA=A2-A1。
復(fù)合體Ⅲ活力單位的計(jì)算:
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下:
(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣) ÷T
=615×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2) 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=124×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.248×ΔA
V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.35×10 -4 L;ε:細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù),1.91×10 4 L/mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn)。
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下:
(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T
=1230×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2) 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=248×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.496×ΔA
V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.35×10 -4 L;ε:細(xì)胞色素 C 摩爾消光系數(shù),1.91×10 4 L/ mol /cm;d:96 孔板光徑,0.5cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn)。
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