H2S 含量測定試劑盒說明書
可見分光光度法 正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
產(chǎn)品內(nèi)容:
提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存。試劑一:液體 25mL×1 瓶,4℃保存。試劑二:液體 15mL×1 瓶,4℃保存。
試劑三:液體 15mL×1 瓶,4℃避光保存。試劑四:液體 15mL×1 瓶,4℃保存。
試劑五:液體 3mL×1 管,4℃避光保存。
產(chǎn)品說明:
H2S 是一種新型氣態(tài)信號分子,存在于腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì),生理濃度的 H2S 對神經(jīng)系統(tǒng)海馬的長時程增強功能具有重要的調(diào)節(jié)作用,并對自發(fā)性高血壓、出血性休克及肝硬化等疾病的過程發(fā)揮著重要的病理生理效應(yīng)。
H2S 與醋酸鋅、N, N-二甲基對苯二胺和硫酸鐵銨等反應(yīng)生成亞甲基藍,亞甲基藍在
665nm 處有最大吸收峰,通過測定其吸光值可計算 H2S 含量。
需自備的儀器和用品:
天平、低溫離心機、可見分光光度計 1ml 玻璃比色皿、蒸餾水。
操作步驟:
一、樣品處理:
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液)進行冰浴勻漿,然后 10000g,4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
2. 細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(10 4 個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議
500 萬細胞加入 1mL 提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7
秒,總時間 3min);然后 10000g,4℃,離心 10min,取上清置于冰上待測。
3. 血清(漿):直接測定。
二、測定步驟: (取 1.5ml 離心管,按照下表操作)
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空白管 |
測定管 |
樣品(μL) |
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250 |
H2O(μL) |
250 |
|
試劑一(μL) |
250 |
250 |
充分震蕩混勻 |
試劑二(μL) |
250 |
250 |
12000rpm,4℃,離心 10min,去上清,留沉淀 |
H2O(μL) |
500 |
500 |
12000rpm,4℃,離心 10min,去上清,留沉淀 |
試劑一(μL) |
250 |
250 |
試劑三(μL) |
250 |
250 |
充分震蕩混勻 |
試劑四(μL) |
250 |
250 |
12000rpm,4℃,離心 10min,取上清 |
試劑五(μL) |
50 |
50 |
混勻,25℃靜置20min,于微量石英比色皿/96孔板中,空白管調(diào)零,測定665nm吸光值,
記為A665。 |
三、H2S 含量計算公式:
標準曲線回歸方程為:y = 0.0044x,R2 = 0.9988
(1)組織樣品
a.按照蛋白濃度計算
H2S(μmol/mg prot)= A665÷0.0044×V 反總÷(V 樣×Cpr)×10-3=0.727×A665÷Cpr
b.按照樣本重量計算
H2S(μmol/g)= A665÷0.0044×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)×10-3 = 0.727×A665÷W
(2)液體樣本
H2S(μmol/L)= A665÷0.0044×V 反總÷V 樣= 727×A665
(3)細胞
H2S(μmol/104 cell)= A665÷0.0044×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細胞數(shù)量(萬個))×10-3
=0.727×A665÷細胞數(shù)量(萬個)
V 反總:反應(yīng)總體積,0.8mL;V 樣:反應(yīng)中樣品體積,0.25mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:蛋白濃度,mg/mL。